許多具有生物活性的生物大分子和亞細胞器很不穩(wěn)定，在分離過程中要求溫度低，操作溫和，不能應用一般的化學分離方法，因此需用到赫西儀器生產的3H20RI高速冷凍離心機。如常用差速離心法分離亞細胞器、線粒體、微粒體和細胞核等，在分離亞細胞的過程中要注意盡可能地保存其原來活性和結構形態(tài)。
試劑：
1、0.25mol/L蔗糖液100ml，pH7.5
稱取蔗糖8.6g溶于少量重蒸餾水，用1mol/LNaOH調整pH7.5，1mol/LNaOH的用量約0.75ml，再加蒸餾水至100ml即可。4℃可保存一周。
2、MA液：4℃保存1~2周。
0.25mol/L蔗糖液8.6g/100ml
10mmol/L Tris-HCL液0.12g Tris/100ml用HCL調pH8.0(約1mol/L HCL0.215ml)
3mMMgCl20.061g/100ml
先配制Tris-HCL液，用該溶液溶解蔗糖和MgCl2至100ml
3、MB液：4℃保存1~2周
配制同MA液，在MA溶液中加0.1ml Triton X-100/100ml
4、MC液：4℃保存1~2周
2.2mol/L蔗糖75.3g/100ml
5、0.4mol/L KCl溶液：2.98g/100ml
6、10％過氯酸(PCA)：取99.8％過氯酸100ml加水至100ml
7、二苯胺—冰乙酸溶液：(新鮮配制)
稱二苯胺1.5g溶于100ml冰乙酸中，再加濃硫酸1.5ml
8、1mol/L NaOH
9、0.01％甲烯蘭溶液
操作
(一)細胞器的分離過程
1、肝勻漿制備：將大鼠斷頭放血處死，迅速取出肝臟，用生理鹽水沖凈肝臟表面的血液，剔去結締組織，稱取1.0克肝組織，剪碎放入盛有0.25mol/L蔗糖液3ml的Tefion-glass勻漿器內，接上電動馬達勻漿，直至無肉眼可見的組織殘塊，再把勻漿倒入離心管，用0.25mol/l蔗糖液2ml沖洗勻漿管，一并放入離心管。
2、線粒體和細胞核的分離，按表操作。
(二)細胞器的鑒定：
1、線粒體的鑒定：在線粒體內有由氧化還原酶類組成的呼吸鏈，包括NADH氧化呼吸鏈和琥珀酸氧化呼吸鏈。在生理條件下，底物脫下的氫可經呼吸鏈徹底氧化生成H2O，并釋放出能量。
但在體外可用甲烯蘭(MB)作為受氫體。MB按受H2則變成甲烯白(MBH2)，顏色由蘭色變白色。
2、細胞核的鑒定：
(1)顯微鏡觀察：用HE染色法，在鏡下觀察核的形態(tài)。
(2)用Burten's法測定DNA濃度：DNA是細胞核內的特征性物質。各種動物的細胞核所含的DNA量是十分恒定的，不受生理條件、環(huán)境因素等的影響。因此可用測定DNA含量來鑒定細胞核。
取水解上清液1ml放入T管，取10％過氯酸1ml放入B管，分別加二苯胺液4ml于T、B管中搖勻后，置80℃水浴10min，取出冷卻后，在分光光度計上(600nm)測吸光度，查標準曲線或用標準管直接計算。
本實驗由m.gyyurun.com整理，轉載請注明。
- 上一篇：血漿HDL-Ch含量的測定(肝素-Mn法)
- 下一篇： 真空離心濃縮儀工藝在保健食品生產中的應用
- 相關鏈接：
- 離心機轉子概論
- 離心機轉子的安裝
- 離心機選型基本原則
- 真空離心濃縮儀的啟示---創(chuàng)新的魅力
- 財務人員參加離心機產品基礎培訓
- 赫西離心機培訓讓我受益匪淺
- 離心機電氣自動化控制技術方案設計
- 羊肉是真是假，用離心機來檢測DNA
- 神奇的血站離心機--讓我和小伙伴們都驚呆了
- 3H系列智能高速冷凍離心機通過四川省科技廳專家組考核
